梅花鹿精液冷冻操作技术

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（一）精液冷冻的理论依据
水的固态分为结晶态和玻璃态两种，梅花鹿精子冻结温度（冰点）是-0.6无，低于此温度就会结冰，水分子形成结晶造成局部高渗透压，致使精子脱水，原生质干涸。另外，由于体积增大等对精子造成机械性损伤，破坏细胞膜，导致精子死亡。精液在冷冻过程中，冰晶在-0.6~-50Y时形成，其中一15~-25无对精子危害最大。为了避免产生冰结晶，必须快速通过此区，而形成玻璃化结晶。因此，冷冻速度越快效果越好。但直接把精子投入液氮中，又会对精子造成低温打击，造成休克。所谓玻璃化，是梅花鹿精子水分保持原来无次序排列，不形成冰晶，而呈坚硬、均匀的团块，原生质没有明显脱水，细胞不遭破坏，可以复苏。另外，保护物质甘油，能防止冷冻中精子形成结晶。由于甘油吸水性强，在冰晶过程中限制水分子晶格排列，使精子不发生脱水，并能缩短危险区。
（二） 精液冷冻方法比较
冷冻精液有3种形式，即安瓶冷冻（因内部降温速度不均，影响冷冻效果等，现几乎不用）、颗粒冷冻（由于剂量不十分标准，易受微生物污染，标记困难，需解冻液稀释，现场操作不便，不便大量、长期地保存，颗粒表面裸露，互相摩擦，精子易脱落等，现在应用的已不多）和细管冷冻（1936年前苏联米洛瓦诺夫首次发明，1950年法国R.Cassou加以改进的技术，具有卫生条件好、容积小、可快速冷冻、精子损耗少、易标记和适于机械化生产等优点）。因此，现常用的是细管冷冻。细管是用无毒塑料（聚氯乙烯）制成，容量有0.25ml和0.5ml两种，管的一端填有棉塞和聚乙烯粉末，粉末遇水即固化自动封口，输精时又成为推送精液的活塞。另一端，在注入精液后，可以以聚乙烯粉末或钢球（或塑料珠）封口，也可用压闭法封口，要注意在封口处与精液间留有几毫米的空隙，以防止在冷冻过程因膨胀引起细管爆裂。
（三） 精液细管冷冻技术
1. 平衡
平衡是指稀释液中的甘油与精子在2〜52条件下互相作用的时间，使甘油对精子起保护作用的目的。将稀释好的装精液的容器用8层纱布包好,放在同温度水杯中，放在2~5T冰箱内，经1小时可达到降温目的，再将甘油加入精液中混匀，分别吸入细管中进行分装，封口，细管精液在分装前要用打印机作好标记，如公梅花鹿品种、生产日期等。在2~5Y冰箱内继续平衡2~4小时。
2. 冷冻
将平衡后精液细管铺在铜网上，将铜网置于距液氮面3~4cm处，网面温度约为-120^,盖上容器盖，冷冻8〜10分钟，然后浸入液氮中。抽样解冻精子活力0.3以上者为合格，装入纱布袋中，在液氮中保存。
3. 贮存
冷冻精液是在液氮中贮存的，要经常定期检查，防止液氮面低于液氮罐的1/3,要及时补充。为防止温度变化对精液品质的影响，取精液动作要迅速，尽量减少在空气中存留的时间。从贮存容器中取冷冻精液时，精液细管不应超过液氮器颈部，以避免因温度回升造成精液解冻率下降。
4. 精液解冻
冷冻精液在解冻过程中会影响精子活力，所以要注意解冻温度和操作技术。细管精液在解冻时将封口端向上、棉塞端向下投入40Y左右的温水中，待细管颜色一变立即取出用于输精。解冻后的梅花鹿精液应立即取样检查活力，凡在0.3以上者方可应用。解冻精液中的梅花鹿精子存活时间较短，应距输精前1小时之内用完，才能保证有较高的受胎率。